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 Long Analysis Plan

Perché il mtDNA funziona quando l'STR fallisce

Il mtDNA esiste in migliaia di copie per cellula, il che lo rende recuperabile da campioni in cui l'analisi autosomica STR fallisce: capelli senza follicolo, scheletro, denti e materiale bruciato o trattato chimicamente (Linee guida ISFG mtDNA 2000). In un caso di incendio doloso, il sequenziamento del mtDNA da un asciugamano di carta bruciato e trattato con ninidrina ha prodotto profili a fonte singola da diversi punti di prelievo quando l'STR non era interpretabile o assente (Caso di asciugamani bruciati e ninidrina). Nei resti scheletrici, i denti hanno prodotto profili STR completi con ampliconi mtDNA di 400 bp, mentre un femore degradato ha richiesto ampliconi di 250 bp (Identificazione di tombe illegali in Argentina). I numeri degli aplopaneli resteranno limitati finché l'amplicone non sarà più breve di ~400 bp, a causa della frammentazione del DNA.

Flusso di lavoro di analisi consigliato

• Estrazione e quantificazione: estrazione con Chelex/QIAamp per tracce; quantificazione specifica del mtDNA tramite qPCR in tempo reale (sistema Applied Biosystems 7500) (Protocolli per il sequenziamento del mitogenoma).
• Amplificazione: utilizzare dimensioni di ampliconi a gradi (250–400 bp) adatte al grado di degradazione (Strategie di dimensione degli ampliconi).
• Sequenziamento: Sanger per la regione di controllo HV I/II; MPS (Illumina MiSeq) per il mitogenoma completo. Il MPS ha recuperato mitogenomi completi da singoli fusti di capelli sfusi con reseze di mtDNA di 646–2.183 mtGE e coperture medie di 6.245–25.598x (MPS da fusti di capelli).
• Genotipizzazione SNP: SNaPshot minisequenziamento di 17 SNPs della regione codificante (ad es. 7028, 10398, 12308) per sottotipizzare gli aplogruppi quando il sequenziamento completo non è fattibile (SNaPshot 17 SNPs mtDNA).
• Interpretazione: riferirsi alle linee guida ISFG: eseguire analisi duplicate, sequenziare entrambi i filamenti, controllare l'eteroplasmia, confrontare con database di popolazione (EMPOP) per frequenze di aplotipo e rapporti di verosimiglianza (Interpretazione forense del mtDNA).

Limitazioni e punti ciechi

ETEROPLASMIA e sottopopolazione complicano la pesatura delle evidenze; la copertura del database è limitata e i tassi di mutazione rimangono incerti (Limitazioni segnalate dalle linee guida). Gli studi di prelievo multiplo sui materiali bruciati provengono da un singolo caso; la generalizzabilità ad altri tipi di evidenza non è stata dimostrata (Avvertenze sulla generalizzabilità del caso). I protocolli MPS dipendono da attrezzature e reagenti specifici che non tutti i laboratori forensi possiedono (Limitazioni specifiche del protocollo). Cosa smentirebbe queste raccomandazioni: un confronto controllato che mostri tassi di falsa inclusione più elevati seguendo le linee guida ISFG, o il fallimento sistematico del MPS nel recuperare mitogenomi da capelli degradati in various contesti di laboratorio.